Nació en la ciudad de El Tocuyo, en municipio Morán (estado Lara), en vísperas de la Guerra Federal.Sus padres fueron Rafael Alvarado y Gracia Benigna Marchena. En el colegio La Concordia (de El Tocuyo), regentado por Egidio Montesinos, recibió la influencia de los clásicos literarios y el conocimiento del latín, aspectos que serán decisivos en su vida intelectual.
En 1871 viajó a Trujillo para finalizar el bachillerato. Al poco tiempo, la carencia de recursos por parte de su familia le obligó a dejar los estudios y trabajar como dependiente en una farmacia en Barquisimeto.En esta época José Gil Fortoul fundó en El Tocuyo, el primer periódico impreso de esa ciudad, El Aura Juvenil, donde Alvarado colaboró frecuentemente como columnista. No obstante, en 1878 se trasladó a Caracas para iniciar estudios de medicina. Durante este lapso estuvo en contacto directo con la intensa vida política del momento, caracterizada por el predominio de Antonio Guzmán Blanco. En lo intelectual pudo conocer el marco doctrinal del positivismo, representado en las enseñanzas de Adolfo Ernst y Rafael Villavicencio. En la UCV Alvarado estudió derecho romano y canónico, mineralogía, cálculo superior y medicina. En tal sentido, Lisandro Alvarado vio confrontada su visión religiosa y tradicionalista de la vida con las nuevas ideas científicas de fines del siglo XIX. En un primer momento, el positivismo influirá en sus investigaciones en el campo de la etnografía, la historia, el lenguaje, así como por su interés por varias culturas antiguas y modernas. En este período Alvarado compartió su saber científico con César Zumeta, Luis López Méndez y José Rafael Revenga,con quienes formó la Sociedad "Amigos del Saber". En 1882 dio a conocer sus primeros trabajos en la Revista Venezolana.
A pesar de su primera inclinación hacia la doctrina positivista, se inscribió en la Academia Militar de Matemáticas y asistió a la Cátedra de Filosofía Intelectual del Colegio Santa María, regentado por Elías Rodríguez. En esa misma época conoció a Cecilio Acosta, el contacto con este, le permitió a Alvarado conectarse a tendencias neoclásicas distintas al positivismo. En 1881, por medio de Acosta pudo conocer a José Martí, quien tuvo una importante influencia en su visión de la vida y la ciencia. El 17 de junio de 1884, Alvarado se gradúo de Bachiller en Ciencias Médicas, su tesis de grado se titulóIndicaciones y Contraindicaciones de la punción en los quistes hidráticos del hígado. El 2 de agostosiguiente se graduó de Doctor en Medicina con la tesis: "La Termometría es uno de los grandes adelantos de la patología" y "Diagnóstico de la hernia inguinal". En1886 figura entre los oradores del Colegio San Agustín (de Barquisimeto), donde pronunció un discurso en el que reafirmó su posición católica y rechazaba las concepciones científicas y filosóficas de sus profesores Ernst y Villavicencio.En este sentido, una vez que obtuvo su doctorado en medicina, Lisandro Alvarado se radicó en Ospino (Estado Portuguesa).
Inició una vida itinerante que rodeó de leyendas su figura. Recorrió el país en lomo de burro, en canoas y a pie, lo que le permitió entrar en contacto directo con la realidad venezolana: los paisajes, la vegetación, la fauna, las costumbres y tradiciones populares, la manera de hablar de las personas, incluyendo los numerosos pueblos indígenas que conoció y cuya lengua pudo estudiar de primera mano.. Las anotaciones de estos viajes constituyó la materia prima de sus obras. En 1887 contrajo matrimonio con Amalia Rosa Acosta Zubillaga con la que eventualmente tiene 7 hijos. Ese mismo año publicó en la revista "La Primera Piedra de Valencia", el poema "Ruinas".
En 1888 se encargó de la Medicatura Rural de Guanare, estando el General Francisco Batalla en la presidencia del Estado Zamora, (hoy Barinas). De Guanare fue enviado como Médico en Comisión al El Tinaco, durante la epidemia de aquel año. De vuelta a Guanare fue Rector del Colegio Nacional.
En abril volvió a Ospino y en 1890, por medio del Gral. Batalla, Alvarado fue nombrado Cónsul en Southampton, Inglaterra. Renunció rápidamente a ese cargo y regresó al país en 1891, y el 26 de septiembre declara su aceptación de la doctrina positivista. En este período redactó varios estudios: Neurosis de hombres célebres de Venezuela (1893) y Sobre las guerras civiles del país (1894). Aparte de estos trabajos, también publicó una serie de trabajos relacionados con la lingüística y la lexicografía, siendo el primero de ellos Ideas sobre la evolución del español en Venezuela (1903), siguiendo con Glosario de voces indígenas en Venezuela (1921), Alteraciones fonéticas del español en Venezuela (1922, reelaborada en 1929) y finalmente su Glosario del bajo español en Venezuela (1929). En 1892 publicó en El Cojo Ilustrado, Arminio y Dorotea, en 1893fue uno de los fundadores del Ateneo de Caracas y diputado el mismo año a la Asamblea Constituyente del estado Zamora. En 1900, también en El Cojo Ilustrado, publicó sus Observaciones sobre la Revolución de 1810, la primera parte de su trabajo sobre Los delitos políticos en la Historia de Venezuela, y Meditación (sobre el Schir Haschirim).
En 1920 regresó a Caracas para trabajar en la Dirección de Política Comercial (del Ministerio de Relaciones Exteriores). Como reconocimiento a su extensa labor en la investigación, fue incorporado como individuo de número de la Academia de Medicina (en 1905), la Academia de la Lengua (en 1922) y la Academia de la Historia (en 1923). Sus Obras completas en 8 volúmenes comenzaron a ser publicadas en 1958; sin embargo, queda todavía una colección inédita de sus manuscritos en custodia de la Academia Nacional de la Historia
Fue masón en grado 30.
Falleció en la ciudad de Valencia (Carabobo) el 10 de abril de 1929. Desde el 14 de mayo de 1980 sus restos reposan en el Panteón Nacional.
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